Captación de hierro a partir de compuestos hemínicos por la cepa sinorhizobium meliloti 242
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Abstract
EI objetivo general del presente trabajo de tesis fue el de caracterizar los mecanismos de adquisicion de hierro mediados por compuestos hemfnicos presentes en Sinorhizobium meliloti 242.
Los objetivos particulares fueron: a) estudiar la funcion de la L-metionina en la adquisicion de hierro a partir de compuestos hemfnicos y b) detectar y purificar las posibles protefnas de membrana externa con capacidad para unirse a hemina, hemoglobina y leghemoglobina.
A partir de ensayos de crecimiento bacteriano en medio Ifquido y bioensayos, se determino que es necesario suplementar al medio mfnimo de cultivo, MV, con L-metionina 300I-lM para que la cepa Sm 242 sea capaz de crecer en medios limitados en hierro con el agregado de diferentes fuentes de este metal (compuestos hemfnicos 0 sideroforos). Cuando se utilizo glutamato en lugar de amonio como fuente de nitrogeno y se agrego L-metionina al medio de cultivo, se obtuvo una mayor produccion de sideroforos y mayores rendimientos celulares. A partir de la informacion disponible, una posible interpretacion de los resultados obtenidos es que en condiciones de baja disponibilidad de hierro, la vfa de asimilacion del azufre a partir del sulfato, este afectada probablemente a nivel de la sulfito reductasa. La L-metionina en estas condiciones serfa una mejor fuente de azufre para la cepa Sm 242.
Se purifico leghemoglobina a partir de nodulos de soja y se obtuvieron anticuerpos de conejo anti-Ieghemoglobina. Estos anticuerpos se caracterizaron por Western blot comprobondose que no presentan reactividad cruzada con otros compuestos hemfnicos ni con las demos protefnas presentes en el macerado nodular. A su vez, por ELISA, se determino la dilucion de trabajo de los anticuerpos, los cuales seron empleados en experimentos futuros.
Por ultimo, mediante anolisis por SDS-PAGE de fracciones enriquecidas en protefnas de membrana externa, se detecto la presencia de 3 protefnas reguladas por hierro de 80, 82 y 90 kDa. De las 3 protefnas identificadas, la de 90 kDa presento la capacidad de unirse a hemina inmovilizada en agarosa. Anolisis por espectrometrfa de masas (EM-MALDI-TOF) determinaron que la protefna de 90 kDa es homologa 0 aun identica a una posible protefna involucrada en el transporte de hierro (Smc02726) deducida a partir del genoma secuenciado de Sm 1021. Anolisis bioinformoticos mostraron que la secuencia aminoaddica de esta protefna presenta dominios altamente conservados con otras protefnas de membrana externa receptoras para la hemina. A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que se ha identificado en Sm 242 un receptor de hemina.
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