Estudio de lipasas de origen vegetal

LIPASAS

HIDROLISIS ENDOGENA

HIDROLISIS EXOGENA

TESIS

TESIS DE DOCTORADO

URUGUAY

El objetivo de esta Tesis fue encontrar nuevas lipasas, extraidas de semillas germinantes que presentaran una actividad hidrolitica importante frente a un a~ Se partió de la hipótesis de trabajo de que las semillas que tuvieran un porcentaje de aceite elevado como reserva energetica podrian poseer lipasas activas para hidrolizarlo in situ durante su germinación. En primer lugar se hizo una busqueda de semillas de distintas familias. Las semillas estudiadas fueron achicoria de raiz (Cichorium intybus), cardo de Castilla (Cynara cardunculus ), girasol (Helianthus annuus L.), colza variedad 00 (Brassica napus cv. Ceres), nabiza (Brassica napus L.), nabo (Brassica napus L. cultivada), repollo blanco (Brassica oleracea L. var. capitata L.), repollo crespo (Brassica oleracea L.), rabanito de punta blanca (Raphanus sativus L. var. Acanthiformis Makino), morr6n (Capsicum annum L.), tomate perita (Lycopersicon esculentum L.), zanahoria (Daucus carota), zapallo de cascara dura (Cucurbita pepo), remolacha (Beta vulgaris L. ). Se analizó su contenido en aceite, asi como otros parametros tales como el contenido de agua y la velocidad de germinaci6n. Esta se consideró como un indice indirecto de la actividad de las lipasas presentes. Una vez que se encontraron las semillas con las caracteristicas buscadas (alto contenido en aceite y periodo de germinación de duraci6n intermedia, menor de 16 dias) se determinó, para cada uno de sus distintos estadios de germinaci6n, la actividad hidrolitica endógena o in vivo y la actividad hidrolitica exógena o in vitro de los crudos preparados con ellas. Todas las semillas presentaron una disminuci6n poco significativa (menos dell 0%) de su contenido en aceite y un aumento de masa apreciable antes del estadio E2 . Todas las semi lIas presentaron algo de actividad hidrolitica in vitro, desde el estadio E1 de su germinaci6n, aunque esta estuvo ausente en todas las semillas sin germinar. En general, no se notó un aumento de la actividad hidrolitica in vitro (medida por el ensayo descripto en la Tesis) a medida que avanz6 la germinaci6n yen la mayoria de los casos, mas bien esta decreció (10 cual no era esperable, de acuerdo con e1 metabolismo normal de las semillas). Solamente las semillas de colza, repollo blanco y tomate perita tuvieron una tendencia clara a alcanzar un maximo en el estadio E4. Los maximos grados de hidr61isis exógena obtenidos, en general, fueron muy bajos (excepto para colza: 47.6%) : achicoria de raiz 4.6%, cardo 11.5%, girasol 17.1 %, morr6n 3.5%, nabiza 9.7%, nabo 13.8%, rabanito 7.3%, repollo blanco 19.4%, repollo crespo 7.0%, tomate perita 17.2%, zanahoria 2.6% y zapallo de cascara dura 2.3%. Se realiz6 un estudio comparativo de las semillas de la familia Brassica: colza variedad 00 (Brassica napus cv. Ceres), nabiza (Brassica napus L.), nabo (Brassica napus L. cultivada), repollo blanco (Brassica oleracea L. var. capitata L.), repollo crespo (Brassica oleracea L.), rabanito de punta blanca (Raphanus sativus L. var. Acanthiformis Makino) ). Dicho estudio indic6 que las semillas no presentaron un comportamiento similar durante la germinaci6n. En particular, las de nabiza, nabo y repollo crespo dieron lugar a crudos con baja capacidad de hidrólisis exógena y las de colza y repollo blanco, con aha capacidad. Luego de realizar los estudios comparativos de la capacidad de hidr61isis endógena y ex6gena, en funci6n de los resultados obtenidos se eligieron las semillas cuyos crudos presentaron mayor capacidad de hidr61isis exógena. Estas semillas fueron cardo, repollo blanco y tomate perita. Con los crudos de estas semillas se optimizaron las condiciones del ensayo de actividad ex6gena: pH, relaci6n gramos semillas I mL buffer, relaci6n gramos crudol mL aceite, tiempo de reacci6n. En base a ello se pudo concIuir que la sensibilidad del grado de hidrólisis exógena respecto de cada uno de estos parametros dependió de la semilla estudiada. Sin embargo, en val ores absolutos, la optimización de estos parametros no modific6 de manera importante el grado de hidrólisis exógena. Se realizó la concentraci6n de las lipasas contenidas en las semillas de cardo, repollo blanco, repollo crespo, nabiza y tomate perita por el metoda de "acetone powder". Se estudi6 el comportamiento de los polvos de acetona frente a distintos sustratos para evaluar la existencia de alglin tipo de especificidad. La comparación del comportamiento de estas lipasas frente a los distintos aceites de origen vegetal (coco, girasol y oliva) no indicó ninguna especificidad, ya que la fracción hidrolizada present6 una composici6n igual a la del aceite original. Cuando las lipasas actuaron sobre un aceite de pescado se observ6 que no habia hidr61isis de los acidos grasos con mas de tres insaturaciones. Las lipasas estudiadas bajo forma de "acetone-powder" de semillas germinantes de nabiza, repollo blanco, repollo crespo, tomate y cardo en el estadio E4 presentaron un comportamiento similar. Se estudi6 el comportamiento de las lipasas purificadas por el metodo de "acetone powder" frente al agregado de distintos cofactores: cloruro de calcio, cloruro de magnesio y Trit6n X 100. Se pudo concluir, en forma general, que los cationes calcio y magnesio y el tensoactivo Trit6n Xl 00 utilizados en las concentraciones indicadas en esta tesis, produjeron una marcada disminuci6n en la actividad de todas las lipasas estudiadas.

Facultad de Química

UdelaR

1998

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Papel

291 p.

Español

Tesis

TD 577.15 FER

Uruguay