Nitración de proteínas  mitocondriales : estudios estructurales y funcionales en especies nitradas de citocromo c y superóxido dismutasa de magneso

BIOQUIMICA

CITOCROMO C

NITRACION

SOD

MnSOD

PEROXINITRITO

CARDIOLIPINA

TESIS

TESIS DE DOCTORADO

URUGUAY

La mitocondria es un el sitio principal de generacion de superoxido y otras especies reactivas y es uno de los principales sitios de formacion de 3-nitrotirosina proteica tanto en condiciones basales como patologicas. En este trabajo se estudiaron dos proteinas mitocondriales, el citocromo c y la superoxido dismutasa de manganese (MnSOD) y de cobre y cinc (CuZnSOD), estudiando tanto la nitracion de estas proteinas como cambios estructurales en condiciones similares alas encontradas in vivo. En el caso del citocromo c se estudio la nitracion de tirosinas proteicas evaluando la presencia de un lipide mitocondrial, la cardiolipina. En los experimentos realizados se observo por diversas tecnicas que en presencia de este Iipido la nitracion de citocromo c expuesto a peroxinitrito se encuentra aumentada, siendo este aumento mediado por un cambio conformacional mediado por la cardiolipina. A nivel estructural, se observaron los cambios sufrido por citocromo 0 en presencia de cardiolipina por tecnicas de NMR para y diamagnetico. Estos experimentos, si bien no fueron concluyentes mostraron que la proteina sufre un cambio conformacional global. Estudios de la reactividad de cada tirosina de citocromo c utilizando mutantes mostro que, en presencia de cardiolipina, tirosinas que no son preferencialmente nitradas 0 modificadas en ausencia de este Iipido estan involucradas en procesos oxidativos tales como la actividad peroxidasa de citocromo c mediada por cardiolipina. Esta actividad peroxidasa se estudio tam bien utilizando un derivado carboximetilado en me\ionina de ci\ocmmo c que, a di~efencia de\ ci\ocmmo c sin modi~icaf pefmi\e \a deteccion de un Compuesto I de peroxidasa. EI agregado de cardiolipina a citocromo c carboximetilado expuesto a peroxido de hidrogeno aumenta la formacion de compuesto I de citocromo c, y por 10 tanto su actividad peroxidasa. Para profundizar el estudio de los cambios estructurales sufridos por citocromo c frente a diferentes oxidantes se sintetizo y purifico citocromo c mononitrado a nivel de Tyr 97 y 74, para generar anticuerpos monoclonales contra formas conformacionalmente modificadas de esta proteina que permitan la deteccion de las mismas tanto en estudios in vitro como in vivo En el caso de las superoxido dismutasas (SOD) se estudiaron las modificaciones sufridas en presencia de flujos de oxido nitrico y superoxido evaluando la capacidad de esta enzima de competir con el oxido nitrico por su sustrato, observandose que en presencia de estos flujos se forma peroxinitrito en concentraciones capaces de inactivar a la enzima y en el caso de MnSOD capaz de nitrarla. Por otra parte se reeestudio la reaccion de MnSOD con peroxinitrito determinando un nuevo valor para la constante de reaccion de 1,9 x 104 M·1s·1 por tetramero. A nivel estructural se estudio el efecto de la nitracion en la accesibilidad del sustrato al sitio activo utilizando metodos in silico donde se determino que la nitracion de Tyr 34, responsable de la inactivacion de MnSOD por peroxinitrito genera un aumento en la barrera de energia libre para el acceso del superoxido al sitio activo, 10 cual impide el acceso al sustrato, tanto por repulsion esterica como electrostatica. Tambien a nivel estructural, se determino el efecto de mutaciones puntuales de MnSOD en la estructura cuaternaria de la enzima, evaluando, a su vez, el efecto de estas mutaciones en la sensibilidad de sus tioles. ----- No se encontraron virus en este mensaje. Comprobado por AVG - www.avg.com Versión: 10.0.1424 / Base de datos de virus: 2437/5174 - Fecha de publicación: 08/03/12

Facultad de Química

UdelaR

2012

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Español

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