Unión orientada en enzimas y simultánea rigidificación de su estructura mediante inmovilización secuencial sobre un nuevo soporte epóxido bifuncional

BIOTECNOLOGIA

INMOVILIZACION DE ENZIMAS

UNION ORIENTADA

UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL

RIGIDIFICACION

TESIS

TESIS DE MAGISTER

URUGUAY

Durante este proyecto de tesis se ha desarrollado un novedoso soporte bifuncional para la inmovilizaci6n de proteinas, que permite combinar las ventajas de la uni6n sitio especifica con las de la inmovilizaci6n covalente multipuntual. EI mismo contiene: i) una pequena proporci6n de gropos tiol-reactivos, y ii) un alto numero de gropos ep6xidos. La optimizaci6n de su sintesis se llev6 a cabo utilizando ditiotreitol 0 sulfuro s6dico como agentes tiolantes, y resinas acrilicas (Eupergit C, EP-Sepabeads) como matrices epoxiactivadas. La inmovilizaci6n en este tipo de soportes es un proceso en dos etapas. Primero la proteina es inmovilizada en forma reversible a traves de un intercambio tiol-disulfuro entre los gropos tiol de la enzima y los gropos tiol-reactivos del soporte bajo condiciones suaves de temperatura (24°C) Y pH (7.0). Luego, en una segunda etapa los gropos ep6xido remanentes del soporte son capaces de formar uniones' irreversibles intramoleculares con los gropos nucleofilicos superficiales de la enzima (principalmente residuos de lisina), debido a su proximidad. Este mecanismo en dos etapas fue verificado por medio del estudio del proceso de inmovilizaci6n de proteinas modelo: i) que presentan naturalmente gropos tiol superficiales (~-galactosidasa de Escherichia coli), y ii) cuyos gropos tiol necesitan ser generados por reducci6n de disulfuros nativos (~-galactosidasa de Kluyveromices lactis) 0 par tiolaci6n con SPDP (penicilina G acilasa de E. coli y lipasa de Rhizomucor miehei). A su vez, estudios de inactivaci6n termica demostraron que las uniones adicionales multipuntuales que se establecen durante la segunda etapa de la inmovilizaci6n, son las responsables de un incremento en la estabilidad de las enzimas inmovilizadas con respecto alas enzimas solubles 0 alas inmovilizadas iInicamente a traves de enlaces disulfuros. Dado que la presencia de gropos sulfhidrilo en la superficie de la estructura proteica es una condici6n esencial para el uso de este nuevo soporte mixto, en el desarrollo de esta tesis se estudiaaran en forma complementaria dos estrategias para la generaci6n de gropos tiol: i) por reducci6n de puentes disulfuros, y ii) por mutagenesis dirigida. Es asi que por un lado, se evalu6 el uso de tiopraapil-agarosa, para la obtenci6n de gropos sulfhidrilo por reducci6n de disulfuros proteicos, como una altemativa al uso de reductores solubles. A su vez, con el fin de poder controlar totalmente la orientaci6n proteica sobre los soportes desarrollados, se estudi6 la viabilidad de introducir residuos de cisteina en la PGA de E. coli por medio de mutagenesis dirigida. Si bien los resultados obtenidos son muy preliminares, 10s mismos alientan a la realizaci6n de investigaciones que permitan estudiar el efecto que podria tener en la estabilidad enzimMica, el inmovilizar la PGA por distintas zonas de su superficie en los soportes desarrollados.

Facultad de Química

UdelaR

2002

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Papel

108 p.

Español

Tesis

TM 66.098 GRA.

Uruguay