Ingeniería de B-galactosidasas en fase sólida en función de sus aplicaciones biotecnológicas

BIOQUIMICA

ESTABILIZACION DE ENZIMAS

INMOVILIZACION DE ENZIMAS

ESTABILIDAD DE B-GALACTOSIDASAS

TESIS

TESIS DE DOCTORADO

URUGUAY

Muchos de los procesos en los cuales seria conveniente el uso de enzimas requieren condiciones de trabajo que general mente son adversas para la estabilidad de las mismas. Ademas el alto costa y la dificultad para regenerarlas condicionan sus posibilidades de aplicaci6n. Los estudios realizados en esta tesis se orientaron hacia la busqueda y caracterizaci6n de estrategias de estabilizaci6n de enzimas mediante procesos de ingenieria enzimMica en fase s6lida. En particular se estudi6 la influencia de los siguientes factores: i) inmovilizaci6n de la enzima; ii) modificaci6n post¬inmovilizaci6n de la superficie del soporte; iii) recubrimiento de la enzima inmovilizada con polimeros hidrofilicos. Se determinaron los parametros de inmovilizaci6n de todos los derivados obtenidos, y se hicieron estudios de estabilidad termica y estabilidad en presencia de sistemas de co¬solventes organicos, con cada uno de ellos. Como enzimas modelo se utilizaron tres f3-galactosidasas de diferentes origenes (E. coli, K lactis y A. oryzae). Se estudiaron dos quimicas de inmovilizaci6n distintas: en glutaraldehido (Glut)-agarosa, elegida como metodo de referencia por ser convencional y ampliamente estudiado; y en tiolsulfinato (TSI)¬agarosa, que es un metoda relativamente nuevo, desarrollado y estudiado en nuestro laboratorio, que utiliza condiciones de inmovilizaci6n suaves. En general, los derivados obtenidos con la quimica del TSI tuvieron rendimientos de inmovilizaci6n mayores, y sus KM fueron menos afectadas que las de los derivados obtenidos con la quimica del glutaraldehido. Sin embargo, estos ultimos exhibieron mejores propiedades de estabilidad termica y frente a solventes, 10 que los hace mas adecuados para biocataIisis bajo condiciones agresivas. Estos resultados demostraron la relevancia de la quimica de inmovilizaci6n en el disefio del biocatalizador. Para modificar las caracteristicas de la superficie del soporte TSI-agarosa, luego de la inmovilizaci6n de la enzima se hizo reaccionar el exceso de grupos TSI con cuatro tiol¬compuestos. De esta manera se consigui6 construir en el entomo de la enzima, cinco nano¬ambientes con caracteristicas diferentes. El comportamiento diferencial de los derivados obtenidos en los estudios de estabilidad termica y frente a solventes organicos, sugiere que cada nano¬ambiente contribuye de forma distinta a la estabilidad de la enzima, dependiendo de las condiciones de desnaturalizaci6n. Es decir que resulta posible modelar las caracteristicas de la superficie del soporte, con el fin de maximizar la estabilidad de la enzima para usarla en una aplicaci6n en particular. La inmovilizaci6n en Glut-agarosa demostr6 ser efectiva para alcanzar estabilizaci6n termica, aun a altas temperaturas; sin embargo no siempre result6 efectiva frente al aumento de la concentraci6n de los co-solventes. La hidrofilizaci6n de los derivados inmovilizados en Glut-agarosa con polimeros de polialdehido-dextrano y poliamina-dextrano, permiti6 una importante estabilizaci6n frente a concentraciones altas de co-solventes; no obstante, la estabilizaci6n alcanzada frente al aumento de la temperatura fue menor. Uno de los resultados mas destacables fue el aumento de la vida media del derivado hiper-hidrofilizado de la enzima de A. oryzae, en presencia de 50% v/v de acetona, en un factor de 25 respecto al derivado sin modificar. Los resultados obtenidos muestran el potencial de esta estrategia de hidrofilizaci6n como una herramienta uti! para alcanzar estabilizaci6n adicional de las enzimas inmovilizadas, frente a condiciones drasticas de concentraci6n de co¬solventes. Los estudios realizados en esta tesis permiten afirmar que es posible el disefio orientado de biocatalizadores en funci6n de sus aplicaciones, mediante diversos procesos de ingenieria de la enzima en fase solida.

Facultad de Química

UdelaR

2005

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Papel

147 p.

Español

Tesis

TD 577.1 IRA.

Uruguay