Calreticulina de Trypanosoma cruzi una Proteína Multifuncional en algunas interacciones Hospedero

INMUNOLOGIA

CALRETICULINA

TRYPANOSOMA CRUZI

ANGIOGENESIS

INMUNIZACION GENETICA

URUGUAY

TESIS

TESIS DE DOCTORADO

El Trypanosoma cruzi es un protozoo hemoflagelado, agente causal de la enfermedad de Chagas 0 Tripanosomiasis Americana, dolencia endemica y cr6nica, que afecta a aproximadamente 18 millones de individuos en America Latina Es un parasito intracelular que convive con su hospedero, por mas de 70 ailos, en un equilibrio del tipo "vivir y dejar vivir". En este contexte son diversos los mecanismos desarrollados por el hospedero para su eliminaci6n y por el parasito para evadirlos, 10 que 10 hace, sin duda, un modelo fascinante para ser estudiado.
En los ultimos ailos hemos clonado, secuenciado y expresado el gen de calreticulina de T cruzi (TcCRJ), proteina de 45kDa, electroforeticamente dim6rfica e inmunogenica [1-5]. Esta molecula fue descrita, por primera vez, en 1991 en ellaboratorio donde se desarro1l6 esta Tesis, como Tc45, un antigeno de T cruzi inmunogeneticamente restringido en ratones [6]. Posee 41% de homologia con calreticulina de Leishmania donovani y mas de un 50% con calreticulina hurnana (HuCRn [1]. TcCRT esta presente en la superficie de tripomastigotes, une Clq y MBL, inhibiendo la ruta clasica del sistema del complemento [7]. Su gen se localiza en diversos cromosomas [1].
Calreticulina (CRn de mamiferos es una proteina multifuncional altamente conservada que une calcio, esta presente en todas las ceIulas de los organismos superiores, excepto eritrocitos. Regula mas de 40 funciones daves, entre ellas se incluyen: chaperona del tipo lectina, sefializaci6n y almacenamiento del calcio, modulaci6n de la expresi6n genica, adhesi6n celular, fagocitosis de celulas apopt6ticas por uni6n a Clq, inhibici6n de la angiogenesis y del crecimiento tumoral, inhibici6n de la actividad litica de las perforinas de ceIulas T y NK, e inhibici6n de la activaci6n del complemento dependiente de Clq. Igualmente, calreticulina esta presente en diversos compartimentos subcelulares.
EI docurnento de esta Tesis se divide en 9 capitulos, de los cuales el pnmero es una revisi6n bibliograficas y en los capitulos 6, 7 y 8, se incluyen revisiones que hemos publicado, recientemente, sobre el rol de calreticulina de parasitos en su interacci6n con el hospedero vertebrado, en lnmunologia, 2002 [8] Y Molecular lnmunology, 2004 [9], y Trends in Parasitology, 2005[10], respectivamente. En el capitulo 9 se incuye una discusi6n general del docurnento de esta Tesis y en el resto de los capitulos se presentan resultados.
Paralelamente al desarrollo de esta Tesis, y de particular interes ha resultado la habilidad de TcCRT para combinarse especificamente con componentes iniciales del Sistema del Complemento (Clq y MBL), 10 que resulta en una importante inhibici6n de la ruta clasica del complemento humano [9]. Es posible, entonces, que T cruzi utilice a TcCRT para modular, en su beneficio, este importante brazo efector de la respuesta inmune. En el capitulo 2 analizamos, en el modelo murino, la capacidad inmunogenica de TcCRT, como proteina recombinante (TcCRTr) y de plasmidios portadores de fragmentos del gen que codifica TcCRT. Tambien, se muestran experimentos preliminares de desafio con tripomastigotes sanguineos de T cruzi, cepa Tulahuen y se analiza la inmunidad pasiva, inducida por anticuerpos policlonales lapinos anti el dominio funcional S, de uni6n a Clq, de TcCRT. Demostramos, en ensayo ELISA, que TcCRTr es inmunogenica en ratones BALB/c y que los anticuerpos generados reconocen la proteina nativa mediante inmunofluorescencia indirecta por microscopia convencional. La inoculaci6n de DNA desnudo con pSec.K2, en ratones BALB/c, genera inmunidad humoral especifica anti TcCRT, analizado en ensayos ELISA. Mediante anaJisis de citometria de flujo, estos anticuerpos reconocen la proteina nativa en el interior y en la superficie de los parasitos, confirmando la expresi6n intracelular y ex.1racelular de esta proteina. Previamente habiamos demostrado que IgG de ratones A.SW (H2') inmunizados con tripomastigotes 0 epimastigotes de T cruzi y suero de pacientes humanos infectados reconocian Tc45 [I, 3, 5]. Ademas, se generaron anticuerpos monoclonales anti TcCRTy tres plasmidios, portadores del gen de TcCRT; pcDNA.KI, pcDNA.K2 y pSec.K2.
Dado que TcCRT posee un segmento con 46% de identidad y 60% de positividad con el fragmento funcional descrito con propiedad antiangiogenica de HuCRT (aa 120-180) y que, sorprendentemente, en ratones y ratas infectados con T cruzi se observa una disminuci6n, e incluso desaparici6n, del crecimiento de diversos tumores trasplantables y espontfuleos, en el capitulo 3 analizamos el efecto antiangiogenico de TcCRT, en un ensayo, in vivo, en membrana alantocori6nica de embriones de polio (CAM). Utilizamos proteina nativa y recombinante, la construcci6n plasmidial pSec.K2, que porta el gen de TcCRT, sin sus secuencias lider y de retenci6n en el reticulo endoplasmico (KDEL) y Betametasona, como control positivo. La capacidad productiva del constructo genico fue verificada por citometria de flujo, mostrando que sueros de ratones inmunizados con el plasmidio recombinante reconocen TcCRT en tripomastigotes de T cruzi, fijados y vivos. TcCRT y pSec.K2 indujeron un efecto antiangiogenico altamente significativo en ensayos CAM in vivo. Los resultados mostrados aqui indicarian que TcCRT, como su contraparte humana, tiene propiedades antiangiogenicas. Probablemente, el efecto antiangiogenico de esta sustancia ocurre preferentemente sobre el crecimiento de tej idos neoplasicos, pero no en tumores establecidos; debido a su efecto sobre la formaci6n de nuevos vasos. Estas propiedades, podrian explicar, al menos en parte, la actividad antineoplasica observada en infecciones experimentales con T cruzi. En este Capitulo, se adjunta un trabajo publicado en Molecular and Biochemical Parasitology, 2005[ II], en el cual mostramos estos resultados. Como informaci6n anexa a este documento se agrega la Figura 51, donde se muestra la vasculatura de membranas tratadas 0 no con TcCRTr.
En el capitulo 4 se presentan resultados donde se observa que TcCRT es una molecula electroforeticamente dim6rfica, codificada por multiples genes localizados en cromosomas cuyo numero varia en funci6n de la cepa 0 clon parasitario y, aparentemente, en el nUmero de copias de genes que codificaria TcCRT presentes en cada cromosoma. En este sentido, se observan desde dos bandas, entre 1.125 y 2.000 kb, en el cion CL Brener y cepas colombianas 2 y 3, hasta en cuatro diferentes cromosomas en las cepas Tulahuen, 2 e Y Y en el clon DM 28c. Ademas, se analiza, en geles de electroforesis de campo pulsado (pFGE), la presencia del gen de TcCRT en clones de T rangeli. Se observa una senal muy debil, por 10 que podria pensarse que el nillnero de copias del gen por cromosoma es muy bajo y/o la secuencia del gen es 10 suficientemente diferente como para dificultar la hibri daci on. Por otra parte, en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDSSPAGE), en condiciones reductoras, TcCRT muestra un dimorfismo electroforetico de 43 y 46 kDa, 10 que permitiria clasificar a las cepas en dos grupos definidos. Aful desconocemos el significado funcional y la naturaleza bioquimica de la beterogeneidad cromosomica y del dimorfismo electroforetico de TcCRT. Estos hecbos sugieren que en T cruzi existe una familia de CRTs 0 moleculas bomologas, abriendo la posibilidad de una variedad de funciones, quizas relevantes en la relacion hospedero/parasito. En este Capitulo, se adjunta un trabajo publicado en Am J Trap Med Hyg, 2000, en el cual mostramos, entre otros datos, los primeros resultados en PFGE, describimos el dimorfismo electroforetico de TcCRT y el uso del anticuerpo monoclonal E2G7, generado en el contexto de esta Tesis, para el clonamiento y expresion de TcCRT.
Ya fuera del contexto de esta Tesis, sera de interes el verificar si Calreticulina del insecto triatomino, al igual que la de otros hematMogos[12], es secretada via salival y si mantiene la propiedad de ururse a Cl (q, r, s) ylo MBL-MAPS, de diversos hospederos potenciales. De ser aS1, el artropodo se protegeria de posibles mecanismos citotoxicos, mediado por el complemento, sobre la mucosa digestiva. Por ello, incluimos en el capitulo 5 un trabajo, recientemente, publicado en Parasitology Research, 2004 [13], con relacion a los habitos alimenticios de Mepraia spinolai. Este es un vector artropodo silvestre de T. cruzi, agente importante, al menos, en la mantencion del cicIo parasitario. AlIi propusimos un simple ensayo para evaluar la importancia de siete especies vertebradas como fuente de alimentacion de M. spinolai. Conejos fueron inmunizados con proteinas sericas de cada una de las siete especies. Luego de titular, una dilucion consenso de 1/100.000 de 10s sueros inmunes detecta protein as sericas vertebradas en el18.9% de contenido intestinal de 131 insectos probados. La mayor proporcion de muestras negativas es consistente con informaciones previas que indican que estos insectos pueden resistir periodos prolongados de ayuno. Altemativamente, elIos se pudieron baber alimentado con sangre de especies de animales diferentes de aquellos de los cuales se genero e1 an tisuero. En aproximadamente el 70010 de las muestras positivas, se detecto un solo origen vertehrado de las proteinas sericas. Todos los sueros preinmunes dieron senal negativa. En 67% de los vectores positivos, se detectaron inmunoglobulinas de conejo directamente por medio de un anticuerpo de cabra especifico. Asi, los conejos silvestres, podrian jugar un papel en la transmision de T. crozi. Estos resultados son complementarios a los ya publicados en J Med Entomol, 2001 [14].
Por otra parte, a pesar de haber participado en otras iniciativas relacionadas con TcCRT, solo las cito y comento brevemente, cuando es relevante, pues forman parte de otras tesis y de publicaciones en las que soy coautora.
En el anexo 1, se adjunta la secuencia nucleotidica del gen TcCRT, Y su traducci6n, publicada por nosotros, en la base de datos de GenBank via NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information), eI 22 de Julio de 1999, con el nlimero de acceso AFI62779.
Esta Tesis fue financiada con recursos estatales de los Proyecto del Fondo de Fomento a1 Desarrollo Cientifico y Tecnologico tFONDEF/CONICYT) ntuneros 1010930, 1970878 Y 2010069.

Facultad de Química

UdelaR

2004

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Papel

213 p.

Español

Tesis

TD 612.017 MOL.

Uruguay