Diseño racional, síntesis y estudio de mecanismo de acción de inhibidores reversibles de caspas -3 como potenciales fármacos frente a la Enfermedad de Alzheimer

QUÍMICA MEDICINAL

QUÍMICA TEORÍCA Y COMPUTACIONAL

CASPAS-3

ALZHEIMER

FARMACOLOGÍA

La Enfermedad de Alzheimer ha sido reconocida como la causa más común de demencia en la población geriátrica, estando presente en aproximadamente el 60% de los casos de demencia. En el año 2016 se estimó que globalmente hay 47.5 millones de personas que la presentan. Al día de hoy no ha sido posible establecer el origen de la enfermedad y se han desarrollado diversas hipótesis. Entre éstas, las que presentan más relevancia son la hipótesis colinérgica, que se basa en la disminución de la acetilcolina en las terminales sinápticas, con la consecuente disminución de la sinapsis colinérgica, y la hipótesis de la cascada amiloide, que inicialmente relacionó la aparición de las placas seniles en los espacios extracelulares con el desencadenamiento de la enfermedad. Ninguna de estas hipótesis ha sido confirmada como disparadora de la enfermedad, y no ha sido posible desarrollar un tratamiento efectivo. Las terapias disponibles no son capaces de revertir o detener el daño causado por esta dolencia. La enzima caspasa-3 constituye un posible blanco terapéutico debido a que está relacionada con la formación del péptido beta amiloide y de los ovillos neurofibrilares por acumulación de la proteína tau. Además, se encuentra sobreactivada selectivamente en etapas tempranas de la enfermedad en cerebro humano. En esta Tesis de Doctorado se buscó diseñar nuevos compuestos orgánicos como posibles inhibidores selectivos y reversibles de caspasa-3 en base a una serie de 10 inhibidores de caspasa-3 y -7 derivados de 2-(1,4-benzodioxan)-1,3-tiazol reportados (Fattoruso et al., 2005, J. Med. Chem. 48, 1649–1656). Se realizaron en primer lugar estudios in silico exploratorios de la interacción de estos inhibidores en caspasa-3 y -7, los cuales fueron publicados (Minini et al., 2017, J. Mol. Struct. 1147, 558–568). A partir de las conclusiones de ese primer trabajo se diseñaron cuatro nuevas series de derivados tiazólicos (derivados de 4-feniltiazol-2-carbamato, 2-amino-4-feniltiazol, 2-amino-4- naftiltiazol y 4-feniltiazol-2-éter). Se obtuvieron 41 de estos derivados mediante metodologías de síntesis orgánica convencional con rendimiento moderado a bajo. Hasta donde se tiene conocimiento, la preparación de la serie de derivados de feniltiazoléter, basada en la síntesis de Williamson de éteres, no ha sido reportada. Se evaluó la capacidad inhibitoria sobre la actividad de caspasa-3 de los derivados obtenidos utilizando enzima recombinante humana y como sustrato un péptido fluorogénico. En ensayos preliminares, a una concentración de 100 μM de compuesto, se obtuvo que ciertos derivados resultaron capaces de inhibir la caspasa-3. Se continuó la caracterización de los derivados seleccionados, realizando estudios preclínicos. Se realizaron ensayos de citotoxicidad de los compuestos en la línea celular de hipocampo de ratón HT22; a una concentración de 100 μM, los compuestos estudiados afectaron en distinta magnitud VI la viabilidad celular. Se evaluó si se generaban metabolitos de los compuestos al ser sometidos a la fracción S9 (citosólica y microsomal) obtenida a partir de un homogeneizado de hígado de rata; seis de los compuestos seleccionados generaron nuevas entidades en las condiciones de ensayo. A su vez, se evaluó la posible capacidad de estos derivados de cruzar la barrera hematoencefálica mediante el ensayo in vitro en paralelo de permeabilidad artificial (PAMPA). Para su realización fue necesario llevar a cabo una técnica para la extracción de lípidos polares de cerebro porcino. Los resultados obtenidos sugieren que los derivados serían capaces de cruzar la barrera hematoencefálica en las condiciones del ensayo. Por último, se evaluó la mutagenicidad de los compuestos mediante el ensayo AMES; sólo uno de los evaluados no resultó mutagénico en ninguna de las cepas de Salmonella entérica typhimurium utilizadas. Paralelamente, mediante estudios in silico de docking ligando-proteína y dinámica molecular de una selección de derivados, se identificaron los posibles sitios de interacción no covalente con caspasa- 3 y -7. Se identificaron como sitios preferenciales de interacción, regiones cercanas a los bolsillos catalíticos de las enzimas. A su vez se estudió si la interacción con estos derivados generaba cambios estructurales en las enzimas, que pudieran explicar la inhibición. En este sentido, la presencia de los derivados no mostró inducir cambios significativos en el posicionamiento de residuos claves para la actividad de las enzimas. Por último, se realizaron ensayos de diferencia de la transferencia de la saturación por resonancia magnética nuclear (RMN) para verificar la posible interacción entre los ligandos y caspasa-3 y -7. No fue posible obtener resultados con estos ensayos debido a problemas en la solubilidad de los derivados en el amortiguador del ensayo y a las altas concentraciones necesarias para su realización. Los intentos para obtener valores de constante de inhibición de los derivados sobre la caspasa-3 fueron infructuosos debido a la interferencia de algunos de los compuestos en el ensayo de fluorescencia así como a problemas en la solubilidad de los mismos, que generaron variabilidad en los resultados obtenidos y no permitieron reproducir los porcentajes de inhibición de los ensayos preliminares. En suma, esta Tesis de Doctorado aporta elementos para el desarrollo de derivados con potencial inhibitorio sobre caspasa

Minini Rivas, Lucía. 

Montevideo: UdelaR, Facultad de Química

2020

Merlino, Alicia(directora de Tesis)

Lavaggia, María Laura (directora de Tesis)

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