Abstract
Este trabajo se centra en una de las enzimas del metabolismo de aminoácidos azufrados, la cistationina b-sintasa (CBS). La CBS cataliza la reacción de condensación de homocisteína y serina para formar cistationina en la primera reacción de la vía de la transulfuración, que conduce a la formación de cisteína a partir de metionina. Además puede catalizar la producción de sulfuro de hidrógeno, molécula de creciente interés por su capacidad de modular procesos fisiológicos en mamíferos, actuando como neuromodulador y vasodilatador. La elevación en la concentración plasmática de homocisteína, que puede deberse a deficiencias en la CBS, constituye por causas aun desconocidas, un factor independiente de riesgo de enfermedades cardiovasculares. La CBS posee un cofactor piridoxal fosfato esencial para la catálisis y un inusual grupo hemo, hexacoordinado con cisteína e histidina, de función desconocida. En el curso del trabajo de doctorado, nos enfocamos en las propiedades redox del hemo de la CBS recombinante humana. El potencial de reducción fue determinado por titulación potenciométrica como −291 ± 5 mV (pH 7.2). Medianteespectrofotometría de flujo detenido, se estudió la cinética de reacción entre el oxígeno y la CBS previamente reducida, determinando una constante de velocidad de (1.11 ± 0.07) x 105 M-1 s-1 a pH 7.4 y 25 °C. La ausencia de cinética de saturación o de especies intermediarias detectables sugirió un mecanismo de esfera externa. Esta reacción dio lugar a la formación de radical anión superóxido. Así, de existir la CBS reducida in vivo, podría constituir una nueva fuente de generación de superóxido en el compartimento citosólico, proponiendo un mecanismo novedoso de formación de especies reactivas a partir de las vías del metabolismo de la homocisteína. También se caracterizó la cinética de reoxidación del producto de reacción de la CBS con monóxido de carbono, el Fe(II)CO, especie para la que se propuso un rol sensor. El conocimiento de la reducción biológica del hemo en la CBS constituye un punto central a la hora de asignar un rol para este cofactor en la proteína, puesto que en estado férrico el hemo es muy estable y no pierde la coordinación con cisteína ni une ligandos exógenos. El valor del potencial de reducción determinado, aunque es bajo, no lo es tanto como para impedir su posible reducción in vivo. Posibles candidatos para efectuar esta reducción en sistemas biológicos, podrían ser flavoproteínas localizadas, al igual que la CBS, en el compartimento citosólico. Por tanto, en este trabajo se exploró la posible reducción de la enzima por fracciones subcelulares citosólicas, así como con flavino reductasas purificadas, obteniendo evidencia de esta reducción en presencia de la enzima metionina sintasa reductasa. Por último se abordó el estudio de la bioquímica del sulfuro de hidrógeno, caracterizando su reactividad con diversos oxidantes de interés biológico. La constante de velocidad para la reacción directa, por dos electrones, con el peroxinitrito fue determinada como (4.8 ± 1.4) x 103 M-1 s-1 a pH 7.4 y 37 °C. A su vez, a bajas concentracione s de sulfuro de hidrógeno se evidenció un incremento en el consumo de oxígeno, consistente con un mecanismo de oxidación por un electrón que inició una cadena de reacciones radicalares. Estas reacciones fueron además estudiadas en forma complementaria mediante simulaciones asistidas por computadora. Las reacciones de oxidación por peróxido de hidrógeno, hipoclorito y taurina cloramina, presentaron constantes de velocidad de (0.73 ± 0.03), (8 ± 3) x 107 y (303 ± 27) M-1 s-1, respectivamente (pH 7.4, 37 °C). A su vez, se comparó la reactividad del sulfuro de hidrógeno frente a estos oxidantes respecto a la de tioles de bajo peso molecular como cisteína y glutatión.
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